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表面等离子共振技术测定**与人血清白蛋白的相互作用
日期：2025-04-27 14:49
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摘要：
表面等离子共振技术测定**与人血清白蛋白的相互作用
摘要：目的 应用表面等离子共振技术（ＳＰＲ）建立一种新的测定白蛋白与化合物相互作用的方法。方法将人血清白蛋白（ＨＳＡ）固定在ＣM５芯片表面。不同化合物的溶液流经固定于芯片表面的ＨＳＡ，ＳＰＲ显示在芯片表面的折射系数变化。分析软件处理数据，用ＨＳＡ流通池得到的数据减去参比池得到的数据进行拟合，确定结合常数。结果 所有测试**与固定的ＨＳＡ可逆结合。紫草素１的平衡结合常数ＫＡ 为３０００Ｌ·ｍｏｌ－１。ＳＰＲ样品需要量*小而且能够自动分析，还可以直接检测小分子（Ｍｒ３０８～５８５）结合，使之适用于评价**与ＨＳＡ相互作用。结论 ＨＳＡ主要的**键合位点没有因为被固定到芯片表面而破坏。验证了ＳＰＲ可以准确简易测定化合物的结合解离。
关键词：表面等离子共振技术；血清白蛋白；药代动力学
中图分类号：Ｒ９６５．２
文献标识码：Ａ
文章编号：１０００３００２（２００７）０２０１４７０５
白蛋白是血浆中含量*丰富的蛋白，因此它对**的分布的影响十分重要。许多化合物能够与白蛋白可逆性的结合。**与白蛋白结合能力强，血液中的游离浓度少，致使其生理活性低。当游离**通过各种途径消除时，循环系统中的**蛋白结合物解离，补充游离**，从而延长**作用时间。因此，在目的生理活性和副作用的微妙平衡之间，**的蛋白结合水平是一项重要的影响因素。理想情况下，每一候选**的游离浓度都应该在应用该**的病人体内测量到。早期测定蛋白结合水平和其他**代谢动力学参数，对**开发很重要。因此需要简单测定蛋白结合水平的方法。目前常用的方法包括平衡透析法、超滤法、超速离心法、分光光度法、亲和与分子排阻色谱以及电泳法。这些方法或依赖于分离结合与游离的**，或需要改变内部参数，例如蛋白迁移或**蛋白结合物的电泳特性。为了使**蛋白相互作用研究简单化，通常会使用单一的蛋白，如白蛋白或α１糖蛋白单体代替血液或血浆［１］。这些方法在筛选多**的蛋白结合时非常有用。有报道，应用固定人血清白蛋白（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）的高效液相色谱真实反映了**与ＨＳＡ的结合［２］。
这些研究结果鼓励作者应用生物传感技术进行血浆蛋白亲和力分析。ＢＩＡｃｏｒｅ系统由微型液体流动系统、传感器芯片和表面等离子体共振（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）光学检测系统３个核心部分组成［３］。ＳＰＲ是一种监测结合动力学非常有用的方法，称为表面等离子体共振技术。广泛应用于研究各种分子相互作用的特性，包括抗体抗原结合、配基受体结合以及蛋白和ＤＮＡ、碳水化合物、小分子和其他蛋白的结合。生物传感技术的主要优点为［４］：可以直接检测化合物的结合不用放射性标记，样品消耗量低、分析自动迅速。本实验基于单浓度样品测试，通过与参照化合物的对比测定目标化合物的亲和常数。
１ 材料与方法
１．１ 药品、试剂、仪器
１，５二咖啡酰奎宁酸（１，５ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ，ＩＢＥ５），**医学科学院放射医学研究所；紫草素１（ｓｈｉｋｏｎｉｎ１，ＡＫＪ１），北京金本草中药科技有限公司；１７烯丙胺基１７脱甲氧基格尔德霉素〔１７（ａｌｌｙｌａｍｉｎｏ）１７ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｉｎ，１７ＡＡＧ〕，深圳生尔易美公司；椒苯酮胺（ｐｅｐｐｅｒｐｈｅｎｔｏｎａｍｉｎｅ，ＪＢＡＴ），中国科学院**研究所；来福昔布（ｌｅｆｕｃｏｘｉｂ，ＬＥ
ＦＵ），中国人民解放军３０１医院；埃坡霉素（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅＤ，ＵＴＤ１），北京华昊中天生物技术公司；华法
林（ｗａｒｆａｒｉｎ），Ｓｉｇｍａ；西格列他钠（ｃｈｉｇｌｉｔａｚａｒ，ＣＳ３８）与西达苯胺（ｃｈｉｄａｍｉｄｅ，ＣＳ５５），深圳微芯生物科技有限公司；ＨＳＡ，Ｓｉｇｍａ。Ｎ羟基琥珀酰亚胺（Ｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ），Ｎ乙基Ｎ二甲基氨丙基碳二亚胺（ＮｅｔｈｙｌＮｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＥＤＣ），瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００生物传感器，瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。ＣＭ５传感芯片，瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。
１．２ 芯片表面活化和白蛋白的耦联固化
按操作说明书将人血清白蛋白耦联固化于ＣＭ５传感芯片上。即用０．２ｍｏｌ·Ｌ－１ ＥＤＣ和０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＨＳ活化ＣＭ５表面７ｍｉｎ后，ＨＳＡ样品用醋酸钠（ｐＨ５．２）稀释为２０ｍｇ·Ｌ－１，耦联到ＣＭ５的ＦＣ３通道，ＨＳＡ进样７ｍｉｎ后用乙醇胺封闭７ｍｉｎ。*终固定水平为１９０００反应单位（ｒｅｓｐｏｎｓｅｕｎｉｔ，ＲＵ），见图１。活化条件相同但表面没有固定ＨＳＡ的ＦＣ２通道设为空白参比。
１．３ 样品测试
化合物用ＤＭＳＯ溶解为母液，用ＨＢＳ（ｍｍｏｌ·Ｌ－１：ＨＥＰＳ１０；ＮａＣｌ１５０；ＥＤＴＡ３）稀释为ＤＭＳＯ含量不大于３％的样品溶液。化合物同时注入参比流通池和ＨＳＡ流通池，结合反应在２２～２４℃，ｐＨ７．４条件下进行，流速为２０μＬ·ｍｉｎ－１。每个循环包括１ｍｉｎ的休息时间以监测基线稳定性，２ｍｉｎ注射样品，１ｍｉｎ解离期。ＡＫＪ１亲和常数测定，以ＨＢＳ缓冲液系列稀释ＡＫＪ１为１９７，１２１，６８．４，３６．６和３．９ｎｍｏｌ·Ｌ－１，将系列稀释ＡＫＪ１与耦联固化在芯片上的白蛋白反应。记录梯度浓度化合物的结合，每一浓度重复测定１次。
１．４ 数据处理
ＳＰＲ信号以信号图形式从ＢＩＡｃｏｒｅ仪器传递到ＢＩＡｃｏｒｅ３０００控制软件中，Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析软件处
理数据，用ＨＳＡ流通池得到的数据减去参比池得到的数据进行拟合，确定结合常数。为了得到ＫＤ 值和饱和浓度的响应（Ｒｍａｘ），化合
物不同浓度（ｃ）的响应（Ｒｅｑ）符合方程：
Ｒｅｐ／Ｍｒ＝ｃＲｍａｘ／（ｃ＋ＫＤ）［５］ （１）
公式中单位点结合的饱和水平Ｒｍａｘ值相同，Ｒｍａｘ作为一个全局参数，不同化合物的剂量响应曲线用相同的Ｒｍａｘ分析，而ＫＤ 作为一个局部参数对每个化合物是不同的。本实验中利用文献报道［６］的华法林的ＫＤ 和本实验数据计算Ｒｍａｘ作为全局参数
计算其他化合物的ＫＤ 值。应用结合百分比平衡方程对比用此方法测得的ＫＤ 值与本实验室得到数据的一致性：
［ＨＳＡ］×［Ｄｒｕｇ］／［Ｄｒｕｇｃｏｍｐｌｅｘ］＝ＫＤ （２）
设定体内血清中白蛋白的浓度为０．６８ｍｍｏｌ·Ｌ－１［５］，ｘ为总体**浓度，ｐ为结合的百分比。方
程２转化为：
（０．６８－ｘｐ）×（ｘ－ｘｐ）／ｘｐ＝ＫＤ［５－６］（３）
可以利用此公式计算已知结合百分比**在某一浓度的亲和常数。
２ 结果
２．１ 固定人血清白蛋白的活性和稳定性
ＨＳＡ主要的**键合位点没有因为被固定到芯片表面而破坏。所有测试**与固定的ＨＳＡ可逆结合。进样几秒钟范围内即可以取得稳态反应。进样完毕**解离迅速，信号立即回归基线。１６５ｎｍｏｌ·Ｌ－１的华法林与ＨＳＡ结合的响应为４５ＲＵ。在作者测试的所有**中，只有１７ＡＡＧ与ＨＳＡ表面的结合能力较低，其他**的结合能力与华法林相似。**与ＨＳＡ的结合强度随着时间的的延长会有一定程度的下降，但不影响同一批样品的响应。
２．２ 平衡常数的测定
图２是ＡＫＪ１的剂量效应曲线。ＡＫＪ１的响应规律经软件拟合显示单位点结合。ＡＫＪ１与ＨＳＡ芯片结合３ｍｉｎ后，用缓冲液洗涤，ＳＰＲ实时监测得到ＡＫＪ１和ＨＳＡ结合解离的ＳＰＲ时间变化曲线。由ＡＫＪ１与ＨＳＡ的结合和解离过程可见ＡＫＪ１与ＨＳＡ
的初期结合迅速，但随时间延长而减缓，洗涤时ＡＫＪ１的解离相对缓慢。分析软件根据不同浓度响应值的变化计算ＡＫＪ１与ＨＳＡ的结合速率ｋａ＝８．１７Ｌ·ｍｏｌ－１·ｓ－１；解离速率ｋｄ＝２．７２×１０－３ ｓ－１；平衡解离常数ＫＤ ＝ｋｄ／ｋａ＝０．３３ｍｍｏｌ·Ｌ－１，平衡结合常数ＫＡ ＝３０００Ｌ·ｍｏｌ－１。
２．３ 高通量测定化合物与人血清白蛋白的相互作用
用高通量的方法分析解离常数，选定的**浓度高到可以给出合理的响应信号，同时也低到可以避免**与多个ＨＳＡ结合位点结合。他们的分子量范围在３０８～５８５之间，之前用平衡透析法测定这些化合物与ＨＳＡ结合水平在８０％ ～９９．９％之间。为了得到不同化合物的结合解离常数，用单结合位点模型拟合数据。采用方程１限定*大反应（Ｒｍａｘ）为整体参数而ＫＤ 为局部参数。ＨＳＡ固定当天ＢＩＡｃｏｒｅ测定的解离常数和本实验室测定的解离常数见表１，亲和力范围在０．２３～８５．９μｍｏｌ·Ｌ－１之间，证明整体拟和方程可以用于确定１００倍范围的亲和力。
２．４ 表面等离子共振技术测定的结合百分比与其他方法的相关性
平衡解离常数与结合百分比之间的转换需要应用质量守恒定律同时假定化合物与ＨＳＡ的结合比例为１∶１，作者应用方程３将ＳＰＲ测定的ＫＤ 转换为结合百分比。假设ＨＳＡ的浓度为０．６８ｍｍｏｌ·Ｌ－１，**浓度为０．１６５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。用ＳＰＲ取得化合物的百分比与其他方法的结果见表１，说明用ＳＰＲ方法测定化合物与ＨＳＡ结合百分比的可行性。为了确定单一浓度是否适合测定化合物与ＨＳＡ的ＫＤ，
选择将ＳＰＲ测定多浓度拟合的ＫＤ 值与单浓度整体方法计算的ＫＤ 值比较，结果非常相似，见表１中ＡＫＪ１亲和力测定结果。
３ 讨论
早期的药代动力学特性评价可以补足**与其药理靶点相互作用数据。汇总后的数据使人们对**功能有更**的了解，也有利于将他们开发为候选**［７］。因为人们对血浆蛋白结合能力强的**特别感兴趣［８］。作者建立了一种基于生物传感技术测定化合物与固定ＨＳＡ结合能力的方法。用整体拟和方法计算实验得到的平衡数据，确定化合物与ＨＳＡ的亲合常数。为了与其他方法得到的结果对比，再用方程３将亲合常数转化为结合百分比。尽管ＳＰＲ结果与其他方法测定的结果并不完全相同，其他方法存在着如样品提取回收率和测定方法定量限较高的问题。考虑到这些，ＳＰＲ方法与其他方法的结果有差异是可以接受的。作者证实以华法林作为http://www.jon-kon.com/goodsid/fenleier/2853033/1.html标准用整体拟和方法测定单一浓度的结合百分比与多系列浓度的结果相似，这极大的加速了ＳＰＲ测定亲和力的通量。
ＢＩＡｃｏｒｅ方法与其他方法相比：ＢＩＡｃｏｒｅ方法前处理简单，只需固定ＨＡＳ，将化合物配置为目的浓度即可测定，而其他方法需要配置样品后离心，透析，样品提取等，操作繁琐；ＢＩＡｃｏｒｅ方法用时短，每
个样品测定在５ｍｉｎ左右完成，而一般的液相测定约１０ｍｉｎ；ＢＩＡｃｏｒｅ方法可以同时测定多种样品，ＳＰＲ测定样品不受样品紫外、荧光吸收、酸碱度不同的影响，而液相测定要根据每个样品的特性建立不同的检测条件；但是ＢＩＡｃｏｒｅ方法还不是一种已推广的方法，所以费用相对较高，而且ＨＡＳ固定后如果不在１周内测定，其活性会降低，不能长期使用。本实验室对ＡＫＪ１的药代动力学评价的过程中，**在生物样品中的含量测定一直是困扰我们的难题，本实验室已经对它的测定方法进行了详细的研究，包括提取和沉淀方法及液相和质谱条件考
察，通过以上考察作者发现，ＡＫＪ１在体内的游离浓度非常低，它在体内可能与离子螯合、与血红素结合或与白蛋白结合，通过本实验作者验证了ＡＫＪ１的确与蛋白的结合能力较高。但不是影响体内测定血浆中**浓度的决定因素，至少在单位点结合时。 同时也测定了ＡＫＪ１的同系物ＡＫＪ２，他们的差别仅在于ＡＫＪ２的侧链末端甲基被ＡＫＪ１的异丁烯基取代，因此ＡＫＪ１可能比ＡＫＪ２多出了一段手臂与ＨＳＡ
结合，与ＨＳＡ的结合能力更高。良好的重复性和ＨＳＡ表面的稳定性使ＳＰＲ技术非常适合预测**的结合水平。这一方法特别之
处在于测定一个样品就可以进行相关研究。而且易操作、提供了必要的信息还避免了复杂的数据分析［９］。ＳＰＲ还用于测定**与ＡＧＰ、脂质体［１０］和肠绒毛膜［１１］的相互作用，将越来越多的应用于**代谢动力学的研究。作者希望ＢＩＡｃｏｒｅ技术应用于大规模测定化合物与ＨＳＡ的相互作用和候选**的结合特性。当目的是增加或降低特定量的结合活性时，ＳＰＲ为临床候选**提供了进行详细结构与活
性研究的可能性。总之，这些特点将使ＳＰＲ生物传感器对**与ＨＳＡ相互作用的研究翻开**性的一页。
摘要：目的 应用表面等离子共振技术（ＳＰＲ）建立一种新的测定白蛋白与化合物相互作用的方法。方法将人血清白蛋白（ＨＳＡ）固定在ＣM５芯片表面。不同化合物的溶液流经固定于芯片表面的ＨＳＡ，ＳＰＲ显示在芯片表面的折射系数变化。分析软件处理数据，用ＨＳＡ流通池得到的数据减去参比池得到的数据进行拟合，确定结合常数。结果 所有测试**与固定的ＨＳＡ可逆结合。紫草素１的平衡结合常数ＫＡ 为３０００Ｌ·ｍｏｌ－１。ＳＰＲ样品需要量*小而且能够自动分析，还可以直接检测小分子（Ｍｒ３０８～５８５）结合，使之适用于评价**与ＨＳＡ相互作用。结论 ＨＳＡ主要的**键合位点没有因为被固定到芯片表面而破坏。验证了ＳＰＲ可以准确简易测定化合物的结合解离。
关键词：表面等离子共振技术；血清白蛋白；药代动力学
中图分类号：Ｒ９６５．２
文献标识码：Ａ
文章编号：１０００３００２（２００７）０２０１４７０５
白蛋白是血浆中含量*丰富的蛋白，因此它对**的分布的影响十分重要。许多化合物能够与白蛋白可逆性的结合。**与白蛋白结合能力强，血液中的游离浓度少，致使其生理活性低。当游离**通过各种途径消除时，循环系统中的**蛋白结合物解离，补充游离**，从而延长**作用时间。因此，在目的生理活性和副作用的微妙平衡之间，**的蛋白结合水平是一项重要的影响因素。理想情况下，每一候选**的游离浓度都应该在应用该**的病人体内测量到。早期测定蛋白结合水平和其他**代谢动力学参数，对**开发很重要。因此需要简单测定蛋白结合水平的方法。目前常用的方法包括平衡透析法、超滤法、超速离心法、分光光度法、亲和与分子排阻色谱以及电泳法。这些方法或依赖于分离结合与游离的**，或需要改变内部参数，例如蛋白迁移或**蛋白结合物的电泳特性。为了使**蛋白相互作用研究简单化，通常会使用单一的蛋白，如白蛋白或α１糖蛋白单体代替血液或血浆［１］。这些方法在筛选多**的蛋白结合时非常有用。有报道，应用固定人血清白蛋白（ｈｕｍａｎｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ，ＨＳＡ）的高效液相色谱真实反映了**与ＨＳＡ的结合［２］。
这些研究结果鼓励作者应用生物传感技术进行血浆蛋白亲和力分析。ＢＩＡｃｏｒｅ系统由微型液体流动系统、传感器芯片和表面等离子体共振（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）光学检测系统３个核心部分组成［３］。ＳＰＲ是一种监测结合动力学非常有用的方法，称为表面等离子体共振技术。广泛应用于研究各种分子相互作用的特性，包括抗体抗原结合、配基受体结合以及蛋白和ＤＮＡ、碳水化合物、小分子和其他蛋白的结合。生物传感技术的主要优点为［４］：可以直接检测化合物的结合不用放射性标记，样品消耗量低、分析自动迅速。本实验基于单浓度样品测试，通过与参照化合物的对比测定目标化合物的亲和常数。
１ 材料与方法
１．１ 药品、试剂、仪器
１，５二咖啡酰奎宁酸（１，５ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃａｃｉｄ，ＩＢＥ５），**医学科学院放射医学研究所；紫草素１（ｓｈｉｋｏｎｉｎ１，ＡＫＪ１），北京金本草中药科技有限公司；１７烯丙胺基１７脱甲氧基格尔德霉素〔１７（ａｌｌｙｌａｍｉｎｏ）１７ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｇｅｌｄａｎａｍｙｉｎ，１７ＡＡＧ〕，深圳生尔易美公司；椒苯酮胺（ｐｅｐｐｅｒｐｈｅｎｔｏｎａｍｉｎｅ，ＪＢＡＴ），中国科学院**研究所；来福昔布（ｌｅｆｕｃｏｘｉｂ，ＬＥ
ＦＵ），中国人民解放军３０１医院；埃坡霉素（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅＤ，ＵＴＤ１），北京华昊中天生物技术公司；华法
林（ｗａｒｆａｒｉｎ），Ｓｉｇｍａ；西格列他钠（ｃｈｉｇｌｉｔａｚａｒ，ＣＳ３８）与西达苯胺（ｃｈｉｄａｍｉｄｅ，ＣＳ５５），深圳微芯生物科技有限公司；ＨＳＡ，Ｓｉｇｍａ。Ｎ羟基琥珀酰亚胺（Ｎｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ＮＨＳ），Ｎ乙基Ｎ二甲基氨丙基碳二亚胺（ＮｅｔｈｙｌＮｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＥＤＣ），瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００生物传感器，瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。ＣＭ５传感芯片，瑞士ＢＩＡｃｏｒｅＡＢ公司。
１．２ 芯片表面活化和白蛋白的耦联固化
按操作说明书将人血清白蛋白耦联固化于ＣＭ５传感芯片上。即用０．２ｍｏｌ·Ｌ－１ ＥＤＣ和０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１ＮＨＳ活化ＣＭ５表面７ｍｉｎ后，ＨＳＡ样品用醋酸钠（ｐＨ５．２）稀释为２０ｍｇ·Ｌ－１，耦联到ＣＭ５的ＦＣ３通道，ＨＳＡ进样７ｍｉｎ后用乙醇胺封闭７ｍｉｎ。*终固定水平为１９０００反应单位（ｒｅｓｐｏｎｓｅｕｎｉｔ，ＲＵ），见图１。活化条件相同但表面没有固定ＨＳＡ的ＦＣ２通道设为空白参比。
１．３ 样品测试
化合物用ＤＭＳＯ溶解为母液，用ＨＢＳ（ｍｍｏｌ·Ｌ－１：ＨＥＰＳ１０；ＮａＣｌ１５０；ＥＤＴＡ３）稀释为ＤＭＳＯ含量不大于３％的样品溶液。化合物同时注入参比流通池和ＨＳＡ流通池，结合反应在２２～２４℃，ｐＨ７．４条件下进行，流速为２０μＬ·ｍｉｎ－１。每个循环包括１ｍｉｎ的休息时间以监测基线稳定性，２ｍｉｎ注射样品，１ｍｉｎ解离期。ＡＫＪ１亲和常数测定，以ＨＢＳ缓冲液系列稀释ＡＫＪ１为１９７，１２１，６８．４，３６．６和３．９ｎｍｏｌ·Ｌ－１，将系列稀释ＡＫＪ１与耦联固化在芯片上的白蛋白反应。记录梯度浓度化合物的结合，每一浓度重复测定１次。
１．４ 数据处理
ＳＰＲ信号以信号图形式从ＢＩＡｃｏｒｅ仪器传递到ＢＩＡｃｏｒｅ３０００控制软件中，Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ分析软件处
理数据，用ＨＳＡ流通池得到的数据减去参比池得到的数据进行拟合，确定结合常数。为了得到ＫＤ 值和饱和浓度的响应（Ｒｍａｘ），化合
物不同浓度（ｃ）的响应（Ｒｅｑ）符合方程：
Ｒｅｐ／Ｍｒ＝ｃＲｍａｘ／（ｃ＋ＫＤ）［５］ （１）
公式中单位点结合的饱和水平Ｒｍａｘ值相同，Ｒｍａｘ作为一个全局参数，不同化合物的剂量响应曲线用相同的Ｒｍａｘ分析，而ＫＤ 作为一个局部参数对每个化合物是不同的。本实验中利用文献报道［６］的华法林的ＫＤ 和本实验数据计算Ｒｍａｘ作为全局参数
计算其他化合物的ＫＤ 值。应用结合百分比平衡方程对比用此方法测得的ＫＤ 值与本实验室得到数据的一致性：
［ＨＳＡ］×［Ｄｒｕｇ］／［Ｄｒｕｇｃｏｍｐｌｅｘ］＝ＫＤ （２）
设定体内血清中白蛋白的浓度为０．６８ｍｍｏｌ·Ｌ－１［５］，ｘ为总体**浓度，ｐ为结合的百分比。方
程２转化为：
（０．６８－ｘｐ）×（ｘ－ｘｐ）／ｘｐ＝ＫＤ［５－６］（３）
可以利用此公式计算已知结合百分比**在某一浓度的亲和常数。
２ 结果
２．１ 固定人血清白蛋白的活性和稳定性
ＨＳＡ主要的**键合位点没有因为被固定到芯片表面而破坏。所有测试**与固定的ＨＳＡ可逆结合。进样几秒钟范围内即可以取得稳态反应。进样完毕**解离迅速，信号立即回归基线。１６５ｎｍｏｌ·Ｌ－１的华法林与ＨＳＡ结合的响应为４５ＲＵ。在作者测试的所有**中，只有１７ＡＡＧ与ＨＳＡ表面的结合能力较低，其他**的结合能力与华法林相似。**与ＨＳＡ的结合强度随着时间的的延长会有一定程度的下降，但不影响同一批样品的响应。
２．２ 平衡常数的测定
图２是ＡＫＪ１的剂量效应曲线。ＡＫＪ１的响应规律经软件拟合显示单位点结合。ＡＫＪ１与ＨＳＡ芯片结合３ｍｉｎ后，用缓冲液洗涤，ＳＰＲ实时监测得到ＡＫＪ１和ＨＳＡ结合解离的ＳＰＲ时间变化曲线。由ＡＫＪ１与ＨＳＡ的结合和解离过程可见ＡＫＪ１与ＨＳＡ
的初期结合迅速，但随时间延长而减缓，洗涤时ＡＫＪ１的解离相对缓慢。分析软件根据不同浓度响应值的变化计算ＡＫＪ１与ＨＳＡ的结合速率ｋａ＝８．１７Ｌ·ｍｏｌ－１·ｓ－１；解离速率ｋｄ＝２．７２×１０－３ ｓ－１；平衡解离常数ＫＤ ＝ｋｄ／ｋａ＝０．３３ｍｍｏｌ·Ｌ－１，平衡结合常数ＫＡ ＝３０００Ｌ·ｍｏｌ－１。
２．３ 高通量测定化合物与人血清白蛋白的相互作用
用高通量的方法分析解离常数，选定的**浓度高到可以给出合理的响应信号，同时也低到可以避免**与多个ＨＳＡ结合位点结合。他们的分子量范围在３０８～５８５之间，之前用平衡透析法测定这些化合物与ＨＳＡ结合水平在８０％ ～９９．９％之间。为了得到不同化合物的结合解离常数，用单结合位点模型拟合数据。采用方程１限定*大反应（Ｒｍａｘ）为整体参数而ＫＤ 为局部参数。ＨＳＡ固定当天ＢＩＡｃｏｒｅ测定的解离常数和本实验室测定的解离常数见表１，亲和力范围在０．２３～８５．９μｍｏｌ·Ｌ－１之间，证明整体拟和方程可以用于确定１００倍范围的亲和力。
２．４ 表面等离子共振技术测定的结合百分比与其他方法的相关性
平衡解离常数与结合百分比之间的转换需要应用质量守恒定律同时假定化合物与ＨＳＡ的结合比例为１∶１，作者应用方程３将ＳＰＲ测定的ＫＤ 转换为结合百分比。假设ＨＳＡ的浓度为０．６８ｍｍｏｌ·Ｌ－１，**浓度为０．１６５ｍｍｏｌ·Ｌ－１。用ＳＰＲ取得化合物的百分比与其他方法的结果见表１，说明用ＳＰＲ方法测定化合物与ＨＳＡ结合百分比的可行性。为了确定单一浓度是否适合测定化合物与ＨＳＡ的ＫＤ，
选择将ＳＰＲ测定多浓度拟合的ＫＤ 值与单浓度整体方法计算的ＫＤ 值比较，结果非常相似，见表１中ＡＫＪ１亲和力测定结果。
３ 讨论
早期的药代动力学特性评价可以补足**与其药理靶点相互作用数据。汇总后的数据使人们对**功能有更**的了解，也有利于将他们开发为候选**［７］。因为人们对血浆蛋白结合能力强的**特别感兴趣［８］。作者建立了一种基于生物传感技术测定化合物与固定ＨＳＡ结合能力的方法。用整体拟和方法计算实验得到的平衡数据，确定化合物与ＨＳＡ的亲合常数。为了与其他方法得到的结果对比，再用方程３将亲合常数转化为结合百分比。尽管ＳＰＲ结果与其他方法测定的结果并不完全相同，其他方法存在着如样品提取回收率和测定方法定量限较高的问题。考虑到这些，ＳＰＲ方法与其他方法的结果有差异是可以接受的。作者证实以华法林作为http://www.jon-kon.com/goodsid/fenleier/2853033/1.html标准用整体拟和方法测定单一浓度的结合百分比与多系列浓度的结果相似，这极大的加速了ＳＰＲ测定亲和力的通量。
ＢＩＡｃｏｒｅ方法与其他方法相比：ＢＩＡｃｏｒｅ方法前处理简单，只需固定ＨＡＳ，将化合物配置为目的浓度即可测定，而其他方法需要配置样品后离心，透析，样品提取等，操作繁琐；ＢＩＡｃｏｒｅ方法用时短，每
个样品测定在５ｍｉｎ左右完成，而一般的液相测定约１０ｍｉｎ；ＢＩＡｃｏｒｅ方法可以同时测定多种样品，ＳＰＲ测定样品不受样品紫外、荧光吸收、酸碱度不同的影响，而液相测定要根据每个样品的特性建立不同的检测条件；但是ＢＩＡｃｏｒｅ方法还不是一种已推广的方法，所以费用相对较高，而且ＨＡＳ固定后如果不在１周内测定，其活性会降低，不能长期使用。本实验室对ＡＫＪ１的药代动力学评价的过程中，**在生物样品中的含量测定一直是困扰我们的难题，本实验室已经对它的测定方法进行了详细的研究，包括提取和沉淀方法及液相和质谱条件考
察，通过以上考察作者发现，ＡＫＪ１在体内的游离浓度非常低，它在体内可能与离子螯合、与血红素结合或与白蛋白结合，通过本实验作者验证了ＡＫＪ１的确与蛋白的结合能力较高。但不是影响体内测定血浆中**浓度的决定因素，至少在单位点结合时。 同时也测定了ＡＫＪ１的同系物ＡＫＪ２，他们的差别仅在于ＡＫＪ２的侧链末端甲基被ＡＫＪ１的异丁烯基取代，因此ＡＫＪ１可能比ＡＫＪ２多出了一段手臂与ＨＳＡ
结合，与ＨＳＡ的结合能力更高。良好的重复性和ＨＳＡ表面的稳定性使ＳＰＲ技术非常适合预测**的结合水平。这一方法特别之
处在于测定一个样品就可以进行相关研究。而且易操作、提供了必要的信息还避免了复杂的数据分析［９］。ＳＰＲ还用于测定**与ＡＧＰ、脂质体［１０］和肠绒毛膜［１１］的相互作用，将越来越多的应用于**代谢动力学的研究。作者希望ＢＩＡｃｏｒｅ技术应用于大规模测定化合物与ＨＳＡ的相互作用和候选**的结合特性。当目的是增加或降低特定量的结合活性时，ＳＰＲ为临床候选**提供了进行详细结构与活
性研究的可能性。总之，这些特点将使ＳＰＲ生物传感器对**与ＨＳＡ相互作用的研究翻开**性的一页。
