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表面等离子共振（SPR）在生物表面化学中的作用
日期：2025-04-26 04:40
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摘要：
第21卷第3期
Vo1．21一NO．3
百色学院学报
JOURNAL OF BAISE UNIVERSITY
2008年6月
Jun．2008
生物表面化学及分子间相互作用研究
琚黎华
(广西机电工程学校，广西南宁 530001)
关键词：表面等离子体激元共振；生物分子相互作用；生物传感器；生物化学
分类号： Q632 文献标识码： A 文章编号：1673—8233(2008)03-0074-05
生物分子之间的相互作用是生命现象发生的基础，一切生命过程都是生物分子之间或生物分子和其它物质分子之间进行接触，相互作用，发生物理和化学变化所引起的[1]。因此，研究生物分子之间的相互作用可以阐明生物反应的机理，揭示生命现象的本质。生物表面化学就是利用一些表面分析仪器或方法，从检测生物分子表面物理、化学特性出发，进而研究生物分子之间相互作用的一个新的研究领域。目前，用来研究生物表面化学的仪器方法有很多，但其中能够实时原位动态地检测生物分子之间相互作用的方法为数很少。表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)由瑞典科学家lied—berg于1983年**用于IgG抗体与其抗原相互作用的测定口]，随后，该技术被引入生物传感器领域并
迅速渗透到基础生命科学研究中。SPR的优点在于能够实时检测生物分子结合反应的全过程，不需要对分子进行标记等。其发展非常迅速，已经成为一种成熟的检测生物分子间相互作用的方法。
1 表面等离子共振的原理及特点:
表面等离子共振(SPR)是一种物理光学现象，表面等离子体(SPR)是沿着金属和电介质之间界面传播的电磁波形成的。当平行表面的偏振光以称之为表面等离子体共振角入射在界面上，发生衰减全反射时，入射光被耦合入表面等离子体内，光能大量被吸收在这个角度上，由于表面等离子体共振而引起界面反射光显著减少。SPR对金属表面电介质的折射率非常敏感，不同电介质其表面等离子体共振角不同，同种电介质，其附在金属表面的量不同，则SPR的响应强度不同。基于这种原理的生物传感器通常将一种具特异识别属性的分子即配体，固定于金属膜表面，监控溶液中的被分析物与该配体的结合过程。在复合物形成或解离过程中，金属膜表面溶液的折射率发生变化，随即被SPR生物传感器检测出来 。
与传统的相互作用技术相比，SPR生物传感器具有如下显著特点：
(1)实时检测，能动态地监测生物分子相互作用的全过程；
(2)无需标记样品，保持了分子活性；
(3)样品需要量极少，一般一个表面仅需约lug蛋白配体；
(4)检测过程方便快捷，灵敏度高；
(5)应用范围非常广泛；
(6)高通量、高质量的分析数据；
(7)能跟踪监测固定的配体的稳定性；
(8)大多数情况下，不需要对样品进行预处理；
(9)由于SPR基于对未穿透样品的反射光的测量，所以检测能在混浊的甚至不透明的样品中进行；
(10)对复合物的定量测定不干扰反应的平衡 。
2 生物表面化学及生物分子相互作用研究— —SPR在生物化学中的应用
质、核酸一核酸之间相互作用的反应动力学，结合位点和反应物浓度等信息。所涉及的研究领域包括免
疫学、酶学和蛋白组学、核酸研究、膜生物学、**筛选等等。
2．1 **学领域
**反应是抗体与相应抗原之间的一种选择性特异结合反应。在抗体分子上，有其相应抗原的特异结合部位，这一部位是与抗原形状相对应的分子空间。由于这种特异的结合，决定了**反应是一种高选择性的反应。通过用SPR技术进行**分析，可以识别抗原的种类，测定抗原的浓度，获得抗原一抗体结合的动力学常数。抗原一抗体亲和力和结合过程中的动态参数不仅可以用来研究结构与功能的关系，对选择不同抗体用于不同用途，如在**、检测、诊断等方面也都具有非常实用的价值。如前所述，SPR技术用于传感器领域所产生的**个传感器就是**传感器。基于SPR原理的实时BIA技术在抗体／抗原结合动力学及抗原表位／抗体的鉴定中有重要的应用，KarlssonI4 等以SPR技术研究HIV一1核心蛋白P 与其单克隆体mAB的结合动力学，从杂交瘤培养上清液中获得抗核心蛋白P mAB，偶联在芯片表面，通过芯片表面直接监测抗体一抗原结合过程，通过结合曲线能够快速半定量不同抗体的动力学参数，得到P 抗体的亲和力常数范围为2．7×1O-7～6．0×10～mol／L。进一步的研究以3O个单抗重组HIV一1核心蛋白P 单抗鉴定P 的特异性抗原表位，结果得到17个抗原表位，应用匹配测试将3O个单抗分成17个**反应模式。该研究工作为抗体／抗原的互作动力学研究提供了通用模式。在临床**中应用SPR技术进行**诊断有着高效和灵敏优势，其中在自身****患者的自身**抗体检测中得到了成功应用：在特定的自身**导致的神经系统**中，血清中抗神经节苷脂抗体滴度是反映病症退行或进展的一个重要生化指标，Alae—dini 等应用SPR技术成功地检测了自身**神经系统**患者体内特异性抗体滴度，并证明以SPR技术检测特异抗体相比于传统ELISA技术在灵敏度、**性及检测速度方面皆有优势。
2．2 蛋白质一蛋白质相互作用研究
将SPR应用于蛋白质分子之间相互作用的研究是一项重要工作，根据SPR光谱有关理论，可计算出结合蛋白质的质量，吸附动力学曲线，解离常数和蛋白质浓度，并可推测出键合反应机理。Housh—mand 等人利用BIAcore等技术从T7噬菌体七肽库中筛选单克隆抗体的抗原结合位点。他们使用的是表达在主要衣壳蛋白上的肽库，测定抗鼠多瘤病毒T一抗原的单克隆抗体F4、F5、LT1的抗原结合部位在多肽链上的位置。他们比较了CM5、F1、C1三种传感片的效果，表明结合都是特异的。相比之下，F1和C1片更易于噬菌体的接近。他们测定了固定抗体与噬菌体和T一抗原的结合，并利用相应序列的肽的竞争结合验证筛选结果，通过解离情况比较了3种抗体与相应噬菌体的结合稳定性。Robinsonl7 应用SPR技术研究在翻译过程起催化作用的氨酰一tRNA合成酶复合物(RS)中心蛋白P 。、P。。、P 。和表面蛋白的结合动力学，获多蛋白系统互作的动力学参数。Stoop ]利用SPR技术筛选和鉴定蛋白质结合功能决定簇的氨基酸位点，通过深入研究血纤维蛋白溶酶原活性抑制剂PAI一1的突变体结构功能区域，发现PAI一1的3个表面抗原决定簇是其不同生物活性的分子基础。有文献报道 ]，在蛋白功能研究中，利用生物分子互作／质谱结合技术(BIS／MS)，一旦发现能与传感芯片上生物分子特异结合的蛋白，就能利用传感芯片上的亲和吸附作用收集和分离足够的纯蛋白，经酶消化后用MS可直接测定该蛋白的氨基酸序列，获得极有价值的蛋白质结构和功能数据。
2．3 蛋白质与其它大分子之间的相互作用蛋白与碳水化合物之间的相互作用有助于我们理解细胞识别的许多方面内容，比如细胞粘连、**反应等等。蛋白与碳水化合物的特异性作用可以发生在糖蛋白、糖脂及分布在细胞表面的多糖部位。蛋白与碳水化合物分子间结合的位点以及蛋白与脂的相互作用研究都可以通过SPR成像技术获取相关信息。Emily研究了Lectin 蛋白ConcanavalinA(ConA)和jacalin与碳水化合物的成键。他首先将两种碳水化合物甘露糖和半乳糖固定在SPR传感器表面，然后使用SPR成像建立了ConA 和jacalin分别与甘露糖和半乳糖表面反应的等温线，并分别测定了吸附系数和解吸系数。jacalin和ConA 与半乳糖和甘露糖的吸附和解吸系数分别为K Ds一2。2±0．8X 10 M _。KD一16± 5tiM ；K ADs一5．6-4-1．7×106M -。，K，n一2OO_+ 50uM 。蛋白与脂的相互作用研究也可以使用SPR成像技术。大多数哺乳动物体内均含有CRP蛋白(Creactive protein)，CRP蛋白在Ca离子存在下能够与PC(Phosphorylcholine)相互作用。从兔子中提取的CRP蛋白、rCRP是由五个相同的亚单元组成的五元
环，环的一边具有键合PC的位点。虽然大多数细胞膜的脂层中均含有极性的PC基团，但是CRP分子只能对坏死的细胞或者微生物细胞中的PC起作用。目前，关于CRP与PC相作用的机制还不清楚。采用三种合成的具有长链极性基团的磷脂(DS8PC、DS6PC、DS3PC)和SPR成像技术，可以得到rCRP分子与磷脂单层相互作用时空间位阻方面的信息。在实验中，将天然的脂DSPC和一种合成的脂以一定的摩尔比混合，然后将其混合物固定于SPR芯片上，然后使其与rCRP相互作用。实验发现，只有DS8PC与DSPC的混合物能有效吸附rCRP，且当DS8PC与DSPC的摩尔比为1：12时，才获得rCRP的*大吸附L】 。
2．4 核酸研究
核酸复杂的结构向来备受人们的关注。用表面固定的DNA单链进行杂交研究对于化学、生物及纳米科学的基础研究和应用是大有裨益的。AlexanderW．Peterson 等研究了SPR在DNA杂交方面的应用。他们首先将DNA探针固定在SPR芯片上，然后用SPR技术研究碱基配对的错配的DNA杂交，证明了探针浓度、表面的不均匀性和非特异性吸附都会对杂交产生影响。转录水平的调控是基因表达调控的主要方式。在真核生物中主要表现为通过转录因子进行调节，在原核生物中典型的表现为操纵子调控。SPR技术正越来越多地用来研究这些过程，其可以实时跟踪复合物多组分间相互作用的特点。Galio_1 等人研究了转录因子huGATA一3与HIV一1长末瑞的3个GA—TA调节元件(sitel，2，3)之间的相互作用，揭示了用常规方法所不能辨别的相对亲和性的区别。同时将含有调控位点的DNA偶联在传感片表面，通过研究这些位点与含有天然转录调节因子的核提取物的相互作用得到了天然huGATA一3的亲和性的半定量结果。SPR方法还能用来研究DNA 的复制和修复。Panayotou_1 等人用缺少催化活力的单纯疱疹病毒I型尿嘧啶一DNA 糖基酶(UDG)的突变体来研究其对底物的识别过程。UDG是～ 类高度保守的DNA修复酶，催化尿嘧啶从DNA链上的删除。他们利用BLAcore研究表明，单链尿嘧啶一DNA 比双链尿嘧啶一DNA与UDG结合牢固，G—U错配比A～U碱基配对与突变体酶的结合更牢固，证明了碱基对的稳定性决定酶与DNA作用的效率，是尿嘧啶而不是DNA分子本身被UDG所识别。Babic 等人利用BLAcore研究大肠杆菌的DNA 修复机理。在大肠杆菌中，大约有10种不同的蛋白质参与了修复过程。他们的研究表明，Muts蛋白在结合错配区以启动修复时，与单链DNA结合松散，与同源双链DNA结合解离迅速；Muts与DNA的结合是碱基特异性的，对G—G错配的亲和力*大。
3 今后工作展望
SPR在研究生物分子之间相互作用上有其优势所在，但是由于生物分子之间的作用涉及的内容丰富、机理复杂，加上SPR方法本身也有一些不足，比如灵敏度有待提高，无法区分非特异性吸附等。今后的工作需要在解决灵敏度和选择性的同时，还需将SPR技术与其它一些方法联用，以获得生物分子之间相互作用机理更深一步的理解。关于这方面的工作，也已经有文献报道。
3．1 纳米技术等在SPR中的应用
据Li等报道l】 ，Severns等人首先提出用亚微米胶粒的放大步骤增强灵敏度的方法，将含有抗原的亚微米胶粒与固定在传感片表面的抗体结合，测定hCG的灵敏度提高了3O倍。He等人提出了利用纳米技术提高SPR灵敏度的方法，他们在DNA杂交实验的SPR研究中，首先将单链DNA 固定在金膜表面，然后将胶体金纳米粒子粘结在单链DNA上，并将其引入样品池中与互补DNA相接触，发生杂交反应，通过金膜和金纳米粒子的电场耦合放大作用，极大地提高了测定DNA的灵敏度。
3．2 生物素一亲和素系统在SPR中的应用
1997年Corn等人用生物素标记的寡聚核苷酸与固定在金膜表面的DNA反应，再让链霉亲和素与生物素标记的寡聚核苷酸反应，将SPR测定的检测限降低了3／4。通过DNA杂交结合及生物素一亲和素连接，可形成6层链状生物素膜，进一步放大了DNA杂交反应产生的SPR信号l】。*近利用生物素 亲和素系统放大作用进f 的SPR实验，将测量灵敏度提高了4×1O 倍，检测l 限达pmol级。
3．3 SPR与其它一些仪器联用
NelsonI— 等将SPR技术与MALDI—TOF质谱结合起来用于生物分子相互作用分析，对分子进行“二维”检测，即SPR技术可对相互作用进行定量分析，而MALDI—TOF则可为研究者提供定性分析的详细结果。他们用SPR监测光纤探针表面多克隆抗体的定向固定，然后用这个探针检测相应的抗原，**个抗体再直接与此抗原结合，探针表面化合物的变化用MALDI—TOFMS分析 可提供键参数的特性。以生物分子互作／质谱(BIA／MS)为技术平台的蛋白质研究系统为蛋白质组学提供了高效有力的工具，在亲和性配体垂钓、蛋白竞争性结合及蛋白结合研究中显示了独特的优势。其中Natsume_】等将SPR与MS联用，结果仅用一个步骤就分离了组织提取液中信号传导蛋白钙调蛋白并测得靶蛋白的序列，为蛋白质组学研究开辟了全新的实验方案。另外，据BlondellelL2。。等报道，他们将反相高效液相层技术(RP—HPLC)用于SPR技术中研究细胞肽与抗微生物肽和细胞膜磷脂的相互作用情况，以了解肽的构象及溶解活性。SPR技术的应用给分子生物学的研究提供了一种全新的手段，它所具有的实时、免标记、动态的特点正是生物表面化学及分子间相互作用研究所希望的，而又是常规分析手段所不具备的，随着SPR技术的不断完善和发展以及SPR技术与其它分析技术的联合使用，必将加速分子生物学的研究进展。
参考文献：
[1]杨帆，杨秀荣．表面等离子共振技术在分子生物学中的
应用EJ]．生物工程学报，2001，17(4)：375—379．
E2]赵晓君，陈换文．表面等离子体共振传感器I：基本原理
EJ]．分析仪器，2006，(4)：1—8．
[3]程慧，黄朝峰．SPR生物传感器及其应用进展EJ]．中国生
物工程杂志，2003，23(5)：46—49．
[4]Karlsson R，Michaelsson A．Kineic analysis of mono—
clonal antibody——antigen interaction with a new biosen—-
sot based analytical system[J]．J Immunol Methods，
2001，(145)：229— 240．
[5]Alaedini A，Latov N．A surface plasmon resonance bio—
sensor assay for measurement ofanti——GM1 antibodies in
neuropathy[J]．Neurology，2001，(56)：855—860．
[6]Houshmand H，Froman G．Magnusson G． P 0_厂T7
display peptides for detemunabon of monoclonal anti—
body specificity and biosensor analysis of the binding
reaction[J]．Analytical Biochemistry．1999，(268)：363—
370．
[7]Robinson JC，Kerjan P，Mirand wM，et a1．Macromolec—
ular assemblage of aminacyl—tRNA synthetases：quan—
titative of protein——protein interaction and mechanism
of complex assembly[J]．J Mol Biol，2000，(304)：983—
994．
[8]Stoop A A，Jespers L．High—density mutagenesis by
combined DAN shuffling and phage display to assign
essential amino acid residues in protein——protein interac—_
tion：application to study structure—function of plas—
minogen activation activation inhibitors一1 (PAJ一1)
[J]．J Mol Biol，2000，(301)：1135—1147．
[9]吴英才，袁一方．表面等离子共振传感器的研究进展[J]．
传感器技术，2004．23(5)：1—5．
[1O]Emily A，Smith，Day Y S，et a1．Direct comparison of
binding equilibrium ， thermodynamic， and rate con—
stants determined by surface——and solution——based bio。。
77
维普资讯 http://www.cqvip.com
《百色学院学报~2008年第3期
physical methodsi,J]．Protein Sci，2002，11(5)：101 7～
1O25．
[11]于萍，崔小强．表面等离子共振技术研究生物膜的进
展[J]．分析化学，2005，33(4)：575—579．
i,12]Alexander W ，Peterson，Feriotto A，et a1．Biosensor
technology for realtime detection of the cystic fibrosis
W1282X mutation in CFTEI,J]．Hum Mutat，2001，18
(1)：7O一81．
[13]Galio L，Briquet S，Cot S，et a1．Analysis of interaction
between^“GA A 一3 transcription factor and thtee
GATA regulatory elements ol Hlv long terminal re—
peat by surface plasmon resonance[J]．Analytical Bio—
chemistry，1997，(253)：70— 77．
[14]Panayotou G，Brown T，Banlow T，et a1．Direct meas—
urement of the suhatrate of uracil——DAN glycosylase
[J]．The Journal of Biological Chemistry，1998，(273)：
45— 5O．
i,15]Babic I，Andrew S E，Jiril F R．Muts interaction with
nusruatch and alkylated base containing DAN molecules
detected by optical biosensor i-J]．Mutation Research ，
78
1996，(372)：87— 96．
[16]李会东．纳米技术在生物学与医学领域中的应用[J]．湘
潭师范学院学报(自然科学版)，2007，(2)：23—27．
[1 7]王海明，钱凯先．表面等离子共振技术在在生物分子互
作研究中的应用[J]．浙江大学学报(工学版)，2006，40
(3)：334— 361．
[18]Nelson R W，Krone J R and Jansson O．Surface plas—
mort resonance biomolecular interaction analysis mass
spectrometry[J]．Anal Chem，2001，(69)：4369—4372．
[19]Natsume T，Nakayamah，Janssono，et a1．Combination
of biomolecular interaction analysis and mechanism of
complex assemblyi,J]．Anal Chem，2000，(72)：4293—
4298．
i,2o]Blondelle S E．Lohner K and Aguliar M．Lipid—in—
duced con{ormation and lipid— binding of cytolytic
and antimicrobial peptodes：determination and biologi—
cal specificity [J]． Biochim Biophys Acta， 2000，
(1462)：89～ 93
